MODUL PRAKTIKUM EXTRACTION OF DNA

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).          

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

I.2 Tujuan Percobaan

1.       untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari Bawang Merah yang dijadikan sampel.

2.       untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel Bawang Merah.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian  dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).

            Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

            Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012). 

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).

CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010).

BAB III

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1ALAT

NO	ALAT	JUMLAH
1.	Petri dish	1 buah
2.	Gelas Beaker	3 buah
3.	Talenan	1 buah
4.	Cutter	1 buah
5.	Sendok teh	1 buah
6.	Matc box	1 buah
7.	Spirtus	1 buah
8.	Kaki tiga	1 buah
9.	Kawat kasa	1 buah
10.	Blender	1 buah
11.	Saringan	1 buah

III.1.2 BAHAN

NO	BAHAN	JUMLAH
1.	Bawang Merah	2 buah
2.	Etanol	Secukupnya
3.	Air	Secukupnya
4.	Detergen	2 sendok teh
5.	Garam	1 sendok teh

III.2 Prosedur Kerja

            Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut:

1. Bawang merah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil.
2. Tuangkan 30 ml air ke dalam gelas beaker.
3. Tambahkan 1 sendok teh garam kedalam gelas beaker lalu aduk
4. Tambahkan 2 sendok the detergen cair kedalam larutan lalu aduk hingga timbul busa.
5. Bawang merah yang telah dipotong, kemudian diblender hingga halus.
6. Tambahkan larutan didalam gelas beaker ke dalam blender
7. Blender semua bahan selama 1-2 menit hingga semua bahan tercampur.
8. Tuangkan hasil campuran kedalam gelas beaker.
9. Panaskan campuran tersebut selam 1-2 menit, lalu amati.
10. Tuangkan campuran bahan kedalam gelas beaker menggunakan penyaring
11. Tuangkan ethanol kedalam petri dish.
12. Tuangkan hasil saringan ke dalam ethanol.
13. Amati DNA yang terjadi pada ethanol.

BAB IV

PEMBAHASAN

            Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

            Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang berasal dari bawang merah. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengisolasi atau memisahkan DNA yang berasal dari bawang merah.

Metode yangdilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta ekstraksi. Perlakuan pertama yang diberikan pada bawang merah yaitu mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran bawang merah mudah dihancurkan menjadi partikel – partikel yang lebih kecil. Tahap selanjutnya yaitu menambahkan campuran detergen dengan air, hal ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua bawang merah tersebut. Perusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang terbentuk antara detergen dengan zat-zat yang ada pada bawang merah. Setelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu penambahana garam dapur sebanyak satu sendok teh ke masing-masing tabung yang berisi campuran bawang merah dan detergen, tujuan dari penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari campuran sehingga benang-benang tersebut akan mudah diamati. Hal ini terjadi karena Na⁺ dalam garam dapat membentuk ikatan pada kutub negative dari ikatan fosfat DNA.Setelah larutan ditambahkan garam larutan kemudian dihomogenkan pada mesin vortex.

            Tahap selanjutnya yaitu penambahan ethanol 96 %, penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benang-benang DNA.Ethanol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan.Setelah ditambahkan ethanol larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin vortex.

            Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil yaitu, perbedaan warna pada masing-masing tabung reaksi yang berisi campuran bawang merah, detergen, garam, dan ethanol.Perubahan warna yang terjadi diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada setiap bawang merah. Selain itu perbedaan yang mencolok dari keenam larutan tersebut adalah terdapat banyak atau sedikit endapan asam nukleat padadasar tabung reaksi. Hal ini terjadi akibat adanya perbedaan kandungan zat serta penggunaan jenis detergen yang berbeda maupun kandungan air dari masing-masing bawang merah tidak sama. Dari percobaan tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya DNA kasar atau benang – benang halus (supernatant) dalam jumlah yang sedikit serta endapan putih yang terlihat. 

BAB V

PENUTUP

 V.1 Kesimpulan

            Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari bawang merah yang dijadikan sebagai sampel. Yaitu melalui cara penghancuran (lisis), ekstraksi, serta pemurnian. Penggunaan detergen dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui membran sel pada setiap sampel bawang merah.Setelah dilakukan percobaan ternyata detergen menghasilkan DNA kasar yang lebih terlihat serta endapan putih yang lebih banyak.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. JJJJJJJakarta.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tttttttttanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada  ssssssstanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tttttttangga17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.